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病毒RNA提取實(shí)驗(yàn)
病毒RNA提取可以:(1)用于RNA病毒復(fù)制機(jī)制研究;(2)用于反向遺傳學(xué)研究;(3)用于分子病毒學(xué)其他研究。實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)驗(yàn)方法
TE-飽和酚/氯仿提取法
實(shí)驗(yàn)方法原理 大多植物病毒RNA 為單鏈RNA ,并且其極性與mRNA 極性相同,植物病毒RNA 提取較為簡(jiǎn)單,一般使用酚氯仿即可獲得滿意結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)材料 試劑、試劑盒 儀器、耗材 抗體 實(shí)驗(yàn)步驟 展開(kāi)一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1. 材料
提純TMV病毒液(10 mg/ml)。
2. 設(shè)備
冷凍臺(tái)式離心機(jī),低溫真空干燥儀,電泳儀,電泳槽。
3. 試劑
TE-飽和酚:氯仿(1:1),氯仿,3 M NaAc(pH5.2),乙醇(100%和70%),TE緩沖液,無(wú)RNA 酶的雙菌水。
二、操作步驟
1. 取一eppendorf管加入提純TMV(10 mg/ml)400 ml,再加入等體積酚/氯仿,蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘,4℃下12 000 g離心10分鐘。
2. 吸取水相于一新eppendorf管,再用酚/氯仿抽提,直至水相和有機(jī)相交界面無(wú)蛋白為止。
3. 吸取水相于新eppendorf心管,加入等體積氯仿,用手倒置離心管數(shù)十秒,4℃下12 000 g離心10分鐘。
4. 取水相,加入1/10倍體積的3 mol/L NaAc(pH5.2),2.5倍體積的冰冷乙醇,混勻,-20℃30分鐘。
5. 4℃下12 000 g離心15分鐘,小心棄去上清液,用70%乙醇洗滌沉淀,4℃下12 000 g離心5分鐘。
6. 小心棄去上清液,沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘,并溶于無(wú)RNA 酶的雙菌水或TE緩沖液中。
7. 取10 ml進(jìn)行電泳分析。注意事項(xiàng) 1. 整個(gè)操作應(yīng)盡可能在低溫下進(jìn)行。
2. 由于病毒RNA 鑲嵌于外殼蛋白里面,因此要充分剝?nèi)ゲ《就鈿さ鞍,一般需要多次進(jìn)行酚/氯仿的抽提。上海金畔生物科技有限公司
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